據(jù)說人體內(nèi)的血管首尾相接長度可達10多萬公里，血液每天在其間奔跑，有的是“高速路”，有的是“國道”，有的又是“鄉(xiāng)間小路”。“新路”往往平滑順暢、暢通無阻，“老路”往往會坑坑洼洼、磕磕絆絆，有沒有可能通過生物技術(shù)的手段對“老路”進行修補呢?

日前，《細胞干細胞》雜志在線發(fā)表了中國科學(xué)院生物物理研究所劉光慧研究組、北京大學(xué)湯富酬研究組和中國科學(xué)院動物研究所曲靜研究組的聯(lián)合研究成果——通過靶向編輯單個長壽基因獲得首例遺傳增強的人類血管細胞。

“我們在人胚胎干細胞中進行基因編輯操作，對編輯后的干細胞進行定向分化，可在實驗室中獲得人類血管內(nèi)皮細胞(血管內(nèi)膜)、血管平滑肌細胞(血管中膜)及間質(zhì)細胞(血管外膜)。”論文通訊作者之一的中國科學(xué)院生物物理研究所研究員劉光慧介紹，遺傳增強的人類血管干細胞有望成為老弱血管“修補劑”，幫助修復(fù)衰老及受損血管，未來可能被應(yīng)用于心肌梗死、缺血性中風(fēng)等疾病的治療中。

腺病毒載體介導(dǎo) 選用“非主流”編輯器

提到基因編輯，CRISPR/Cas9技術(shù)名聲在外，它與ZFN、TALEN技術(shù)并稱為基因編輯“三大利器”。但此次選用的基因編輯技術(shù)卻并不是其中之一，而是被稱為輔助病毒依賴的腺病毒載體(HDAdV)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)。

這個一口氣讀不下來的名字需要拆分來理解。腺病毒載體是這款“基因編輯器”有效的核心，它能被細胞“吞”進去，并不會止步于細胞質(zhì)，卻能夠進入到細胞核中，因為要對基因進行編輯、改寫、擦除等等操作，必須走進基因的“大本營”細胞核中。

然而腺病毒載體會保持在染色體外，并不整合進入宿主細胞基因組中，這樣不會對人類基因組造成損傷。

“我們使用的是第三代腺病毒載體，缺失了腺病毒的基因組序列，因此大大降低了病毒載體的毒性。”劉光慧說，可以理解為，經(jīng)過技術(shù)改造，只保留了腺病毒“裝卸貨”的功能，而它的病毒特性已經(jīng)完全擯棄了。

當(dāng)“HDAdV腺病毒號”貨車攜帶的DNA同源重組序列進入細胞核后，會自動完成基因組靶序列的搜索和置換工作。“HDAdV技術(shù)完全利用超大片段DNA同源重組的原理進行基因編輯，一般不會造成如CRISPR/Cas9一樣的脫靶效應(yīng)。”劉光慧介紹，它可攜帶長達25—37kb的超長DNA片段進入人類細胞核，置換基因組的固有片段，進而實現(xiàn)高效精準(zhǔn)的基因編輯。

技術(shù)越用越純熟，劉光慧研究組對HDAdV技術(shù)的應(yīng)用研究已經(jīng)積累多年。早在2011年，劉光慧等利用HDAdV基因編輯技術(shù)首次在人類疾病干細胞中實現(xiàn)了致病基因突變的高效精準(zhǔn)矯正。研究組研究生顏鵬澤接受采訪時表示，CRISPR/Cas9技術(shù)才剛剛問世、尚沒有在人類細胞中應(yīng)用時，實驗室已經(jīng)熟練利用HDAdV技術(shù)矯正或敲入了若干種人類致病基因突變。同時也多番證明HDAdV基因編輯技術(shù)的安全性，相關(guān)文章發(fā)表于《自然》《科學(xué)》《細胞》和《細胞干細胞》等雜志。2017年，研究組更是通過HDAdV技術(shù)產(chǎn)生了國際上首例遺傳增強的人類間充質(zhì)干細胞。

編輯FOXO3基因 它是長壽界“名門閨秀”

工欲善其事、必先利其器。有了趁手的技術(shù)和精巧的技藝，要使得血管細胞“年輕化”，應(yīng)該對哪段基因?qū)嵤┚庉嬆?

“FOXO3是最保守的、也是公認(rèn)的與長壽相關(guān)的基因。”劉光慧說，F(xiàn)OXO家族是一類轉(zhuǎn)錄因子，在上世紀(jì)90年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)FOXO家族同源蛋白可能參與了動物壽命的調(diào)控。

隨著研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)FOXO3基因與人類長壽的確相關(guān)。更進一步的研究精細到單個核苷酸。基本思路是，將百歲長壽老人群體的FOXO3基因與平均壽命78.5歲的老人對比，找到這個區(qū)域內(nèi)的核苷酸變異，逐步縮小與長壽直接相關(guān)的位點范圍。更進一步的研究表明，許多國家地區(qū)的人在FOXO3基因中都能找到長壽相關(guān)的核苷酸變異。

研究組決定對FOXO3基因進行編輯，還由于它能發(fā)揮“一石二鳥”的作用。干細胞應(yīng)用于人體其實有著很高的難度，猶如平衡“蹺蹺板”，干細胞的狀態(tài)必須恰到好處，如果太“瘋狂”可能成為腫瘤，如果太“弱小”有可能由于是外來細胞被機體消滅。

“研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3具有維持血管穩(wěn)態(tài)的功能。”劉光慧說，它本身是一個轉(zhuǎn)錄因子，能激活下游的多個細胞保護的信號通路，F(xiàn)OXO3的活化還可通過誘導(dǎo)抑癌基因表達抵抗腫瘤形成，因此選擇FOXO3能同時提高細胞治療的效率和安全性。

為了證明這一點，研究組還將多種致癌因子導(dǎo)入了遺傳增強的血管細胞中，發(fā)現(xiàn)它也可以有效抵抗癌基因誘導(dǎo)的細胞惡性轉(zhuǎn)化，這大大降低了利用這些細胞進行治療的安全隱患，使得干細胞向臨床應(yīng)用邁向了堅實的一步。

是“節(jié)流”不是“開源” 調(diào)控細胞運轉(zhuǎn)“管理層”

FOXO3基因編碼的FOXO3蛋白，實質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子。它的工作地點是細胞核內(nèi)，通過與基因的特定序列專一性結(jié)合，保證基因表達“有秩序”“有規(guī)律”。形象地說，它們是細胞生命運轉(zhuǎn)中的“管理層”。

細胞內(nèi)部對“管理層”也有“彈劾”制度。在一定狀態(tài)下，比如細胞感到“吃飽喝足”了，就會通過PI3K/AKT通路磷酸化修飾FOXO3蛋白，讓這種蛋白打上磷酸化的“標(biāo)簽”，隨后這些FOXO3蛋白就被“奪權(quán)”了，活性被抑制，最終“下臺”被請出細胞核。

“了解了這樣的調(diào)控機制，我們選擇了‘節(jié)流’而不是‘開源’。”劉光慧說，為了對基因組改動最小，研究組并不增強FOXO3基因表達，而是通過2個堿基的置換保證FOXO3蛋白不被“彈劾”而且“連任”。

“我們使用HDAdV介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)置換了人胚胎干細胞中FOXO3基因的第3號外顯子中的兩個單核苷酸，使FOXO3蛋白轉(zhuǎn)錄因子不能有效地被AKT磷酸化，從而抑制了FOXO3蛋白的磷酸化和降解，促進FOXO3在細胞核內(nèi)的聚集進而激活下游‘有益’靶基因的表達。通過對人類基因組中的兩個核苷酸進行精準(zhǔn)編輯，最大限度地保持了人類基因組的完整性。”劉光慧說。

經(jīng)過基因編輯的干細胞被定向分化為不同的遺傳增強型人類血管細胞后，進行了相關(guān)動物實驗。實驗表明，小鼠腿部大動脈血管處被人為結(jié)扎后，向腿部輸送血液的道路就被封住了。把遺傳增強的血管細胞注射到腿部后，與注入未經(jīng)過遺傳增強的未經(jīng)基因編輯的血管細胞的對照組相比，前者有著更強的自我更新、抵抗氧化損傷及延緩細胞衰老等能力，可高效促進受損血管再生，迅速恢復(fù)缺血部位血流。